宾夕法尼亚州立大学生物化学和分子生物学副教授Joyce Jose说：“SARS-CoV-2疫苗的目标是刺突蛋白，但这种蛋白处于强大的选择压力之下，正如我们在Omicron身上看到的那样，它可能发生重大突变。仍然迫切需要SARS-CoV-2的治疗药物，这些药物针对的是病毒中除刺突蛋白以外的其他部分，这些部分不那么容易进化。”
以前的研究表明，两种SARS-CoV-2酶--包括Mpro和PLpro的蛋白酶--是有希望成为抗病毒药物开发的目标。例如，辉瑞公司的COVID-19疗法Paxlovid针对Mpro。据Jose称，这些酶是相对稳定的；因此，它们不太可能迅速产生耐药性突变。
宾夕法尼亚州立大学生物化学和分子生物学教授Katsuhiko Murakami指出，这些病毒蛋白酶由于具有裂解或切割蛋白质的能力，对SARS-CoV-2在受感染细胞中的复制至关重要。
“SARS-CoV-2从其RNA基因组中产生长的蛋白质，称为多聚蛋白，这些蛋白质必须被这些蛋白酶有序地切割成单个蛋白质，导致形成功能性病毒酶和蛋白质，一旦进入细胞就开始病毒复制，”Murakami解释说。“如果你抑制了这些蛋白酶中的一种，就可以阻止SARS-CoV-2在感染者中的进一步传播。”
这些发现于2月25日发表在《通信生物学》杂志上。
该团队设计了一种检测方法，在活的人类细胞中快速识别Mpro和PLpro蛋白酶的抑制剂。
Jose说：“虽然有其他的检测方法，但我们设计的新型检测方法可以在活细胞中进行，这使我们能够同时测量抑制剂对人类细胞的毒性。”
研究人员用他们的检测方法测试了64种化合物库--包括艾滋病毒和丙型肝炎蛋白酶的抑制剂；发生在某些原生动物寄生虫中的半胱氨酸蛋白酶；以及二肽基肽酶，一种参与2型糖尿病的人类酶--以测试它们抑制Mpro或PLpro的能力。从这64个化合物中，研究小组确定了11个影响Mpro活性的化合物和5个影响PLpro活性的化合物，其截止点是蛋白酶活性降低50%，细胞存活率为90%。
生物化学和分子生物学副研究教授Anoop Narayanan使用活体共聚焦显微镜监测了这些化合物的活性。
Narayanan说：“我们设计的实验是，如果化合物影响了蛋白酶，你会在细胞的某些区域看到荧光。”
接下来，该团队在宾夕法尼亚州立大学Eva J. Pell ABSL-3高级生物研究实验室的BSL-3设施中评估了16种PLpro和Mpro抑制剂对SARS-CoV-2病毒的抗病毒活性，并发现其中8种对SARS-CoV-2具有剂量依赖的抗病毒活性。具体来说，他们发现Sitagliptin和Daclatasvir抑制PLpro，而MG-101、Lycorine HCl和Nelfinavir mesylate抑制Mpro。其中，研究小组发现，MG-101还通过抑制蛋白酶对刺突蛋白的处理，阻碍了病毒感染细胞的能力。
“我们发现，当用选定的抑制剂预处理细胞时，只有MG-101影响病毒进入细胞，”Narayanan说。
此外，研究人员发现，用Mpro和PLpro抑制剂的组合处理细胞具有额外的抗病毒效果，对SARS-CoV-2的复制提供了更大的抑制。
Jose说：“我们的研究表明，在细胞培养中，如果你把Mpro和PLpro抑制剂结合起来，就会对病毒产生更强的效果，而不会增加毒性。这种组合的抑制作用是非常有力的。”
为了研究MG-101抑制Mpro蛋白酶活性的机制，包括生物化学和分子生物学博士后学者Manju Narwal在内的科学家们使用X射线晶体学获得了MG-101与Mpro复合的高分辨率结构。
“我们能够看到MG-101是如何与Mpro的活性部位互动的，”Narwal说。“这种抑制剂模拟了多聚蛋白，并以类似的方式与蛋白酶结合，从而阻断了蛋白酶与多聚蛋白的结合和切割，这是病毒复制的一个重要步骤。”
Murakami补充说：“通过了解MG-101化合物如何与活性部位结合，我们可以设计出可能更加有效的新化合物。”
事实上，该团队正在根据他们通过X射线晶体学确定的结构设计新化合物。他们还计划测试他们已经在小鼠体内证明有效的组合药物。
尽管科学家们研究了SARS-CoV-2的Delta变体，但他们说这些药物很可能对Omicron和未来的变体有效，因为它们针对的是病毒不太可能发生重大变异的部分。
Jose说：“开发针对各种冠状病毒的广谱抗病毒药物是针对循环和新出现的冠状病毒感染的最终治疗策略。我们的研究表明，重新利用某些FDA批准的药物，这些药物在抑制Mpro和PLpro的活动方面表现出有效性，可能是对抗SARS-CoV-2的一个有用策略。”